實(shí)現(xiàn)多重檢測 我國推動實(shí)時熒光PCR技術(shù)再上新臺階
【化工機(jī)械設(shè)備網(wǎng) 熱點(diǎn)關(guān)注】近期，廈門大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)成功研發(fā)出一種熒光PCR新技術(shù)，將熒光PCR的單管檢測能力提高了至少一個數(shù)量級，推動了主流熒光PCR儀器檢測技術(shù)的發(fā)展。研究成果發(fā)表在《美國國家科學(xué)院院刊》(PNAS)雜志上。
作為目前最為成熟、臨床應(yīng)用最廣泛的分子診斷技術(shù)，PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、及時方便等優(yōu)點(diǎn)，在傳染性疾病檢測、腫瘤個體化診療、遺傳性疾病篩查、血液篩查等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用價(jià)值，已經(jīng)成為許多臨床診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。在疫情期間，PCR技術(shù)在病毒核酸檢測中發(fā)揮了重要作用，其發(fā)展也更受重視。
PCR技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)衍生出多重PCR (multiplex PCR)、實(shí)時熒光定量PCR、數(shù)字PCR(digital PCR)等多種技術(shù)。其中第二代技術(shù)——實(shí)時熒光定量PCR是當(dāng)前的主流。該技術(shù)通過特異性熒光探針實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增片段熒光信號，同時實(shí)現(xiàn)了絕對基因表達(dá)和相對定量檢測。同時通過閉管檢測的模式降低了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染機(jī)會，節(jié)省時間和勞動力，有利于自動化的實(shí)現(xiàn)。
然而實(shí)時熒光定量PCR的檢測能力受限于儀器檢測通道數(shù)目，單個反應(yīng)能檢測到的靶基因數(shù)量很難超過6個(2-4)。在PCR之后添加熔解分析步驟是研究者解決這一問題的嘗試，雖然在一定程度上增加了可檢測靶基因數(shù)目，但也存在檢測成本升高、檢測錯誤率增加等問題。靶基因檢測數(shù)量的局限使實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在涉及多靶點(diǎn)的復(fù)雜疾病檢測中難以發(fā)揮作用。
2022年2月24日，廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)在《美國國家科學(xué)院院刊》(PNAS)雜志上發(fā)表了一項(xiàng)研究成果，報(bào)道了一種稱為“MeltArray”的單步、多重均相熒光PCR新技術(shù)。
該技術(shù)利用了熒光PCR反應(yīng)中Taq DNA聚合酶的5‘-瓣?duì)顑?nèi)切酶活性，將位于引物下游的“媒介探針”切割，釋放出“媒介引物”，“媒介引物”結(jié)合到反應(yīng)體系中的分子信標(biāo)報(bào)告探針上。在Taq酶聚合活性作用下，“媒介引物”沿著分子信標(biāo)延伸，生成具有特定熔點(diǎn)值的熒光雙鏈。由于每個分子信標(biāo)可以允許多個“媒介引物”形成一系列具有不同熔點(diǎn)值的熒光雙鏈，單個MeltArray多重?zé)晒釶CR反應(yīng)可檢測的總靶基因數(shù)目就等于反應(yīng)中分子信標(biāo)數(shù)量乘以其所容納的“媒介引物”數(shù)量。
為驗(yàn)證MeltArray的多重檢測能力，研究者設(shè)計(jì)了多種檢測體系，包括人類Y染色體微缺失的20重檢測、確定大腸桿菌血清型的62重檢測、同時識別和定量呼吸道病原體的24重檢測、直腸癌組織樣本的KRAS突變微測序分析等，對應(yīng)了分子診斷的遺傳病、傳染病和腫瘤分子診斷三大應(yīng)用領(lǐng)域，均有良好的靈敏度和特異性。
在高通量測序技術(shù)出現(xiàn)后，靶基因檢測數(shù)量有限的實(shí)時熒光定量PCR通常被認(rèn)為是“低端”的檢測技術(shù)。MeltArray不需要改變現(xiàn)有的熒光PCR儀器就極大增加了單個閉管實(shí)時熒光PCR一步法能檢測的最大靶基因數(shù)量，推動熒光PCR這一“老技術(shù)”再上“新臺階”，填補(bǔ)了長期存在于低階PCR和高通量檢測二者之間的技術(shù)空白。
(資料來源：科技部生物中心、IVD從業(yè)者網(wǎng))
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