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實(shí)驗(yàn)方法原理    通過(guò)特異的抗原抗體反應(yīng)標(biāo)記上可見的顯示物系統(tǒng)來(lái)檢查細(xì)胞及組織上原位抗原或抗體成分的方法。在光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其性質(zhì)定位，還可以利用細(xì)胞分光光度計(jì)、圖像分析儀、共聚焦顯微鏡等進(jìn)行細(xì)胞原位半定量測(cè)定。免疫組織化學(xué)的顯著特點(diǎn)是特異性強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)材料    冷凍切片
試劑、試劑盒    一抗；二抗；三抗（*標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶卵白素）；PBS緩沖液；多聚甲醛；DAB
儀器、耗材    免疫濕盒；滴管；剪刀；進(jìn)口膜（parafilm）；37度培養(yǎng)箱；移液槍及槍頭；酶標(biāo)筆（PAP）；光學(xué)顯微鏡
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  將實(shí)驗(yàn)用試劑從4度冰箱取出，自然平衡至室溫；
 
2.  將腦片從-20/-80度冰箱中取出，自然平衡至室溫。
 
3.  用酶標(biāo)筆在腦片周圍畫圈，防止液體在玻片上溢流。
 
4.  4%多聚甲醛固定30 min。
 
5.  0.01M PBS洗，5 minX3次。
 
6.  0.4% Triton-X100/0.01 M PBS 洗10 min X 1次。
 
7.  0.01M PBS洗，5 min X 3次。
 
8.  0.3% H2O2/0.01 M PBS 洗10 min X 1次。
 
9.  0.01M PBS洗，5 min X 3次。
 
10.  以10%山羊血清（1：10，以0.01M PBS稀釋），37度恒溫箱放置30 min，一般以40 ul/腦片為宜。
 
11.  傾去封閉血清液，略干，加一抗，4度冰箱放置過(guò)夜。

12.  0.01M PBS洗，5 min X 3次。
 
13.  加二抗（1：200稀釋度），37度恒溫箱放置1h，一般以40 ul/腦片。
 
14.  0.01M PBS洗，5 min X 3次。
 
15.  加三抗（1：300稀釋度），37度恒溫箱放置1h，一般以40 ul/腦片。
 
16.  0.01M PBS洗，5 min X 3次。
 
17.  DAB顯色（DAB配置：1 ml水中，加1滴A液，混勻后，加1滴B液，再1滴C液），顯色約10 min。

收起 
注意事項(xiàng)    
1.  內(nèi)源性生物活性及其消除*是一種輔酶，是在脫羧基酶、羧基轉(zhuǎn)換酶等催化的代謝環(huán)節(jié)中所產(chǎn)生的羧基中間載體，在應(yīng)用ABC法染色時(shí)會(huì)與抗*蛋白結(jié)合而產(chǎn)生非特異性染色。對(duì)含內(nèi)源性*或*樣物質(zhì)較豐富的組織，在應(yīng)用ABC法前，應(yīng)預(yù)先以0.01％的抗生素蛋白和0.01％*溶液分別作用20分鐘左右，以消除內(nèi)源性*活性。每次作用后應(yīng)用PBS洗5分鐘，更換3次。
 
此外，zui近已有從鏈霉抗生素蛋白（streptavidin）由于其分子中不含寡糖及等電點(diǎn)接近中性（6－6.5），故非特異性吸附很低。同時(shí)鏈霉抗生素蛋白可與長(zhǎng)臂*及過(guò)氧化物酶結(jié)合成復(fù)合物，此為SABC（streptavidin-Biotin-peroxidase Complex）復(fù)合物，用SABC取代ABC進(jìn)行標(biāo)記，可提高靈敏度（比ABC高約20倍）及降低非特異性著色?，F(xiàn)在SABC已有成品的試劑盒出售。SABC法的操作步驟基本與ABC法相同，只不過(guò)要用SABC代替ABC標(biāo)記，即將SABC試劑盒中的A液、B液各取10微升，加入1 ml的PBS中（臨用前配，配好后立即加入切片中）室溫孵育30分鐘。此外*級(jí)抗體和第二級(jí)抗體的孵育時(shí)間均可縮短至30分鐘以內(nèi)，故SABC法是一個(gè)快速、簡(jiǎn)便、敏感及非特異性著色低的檢測(cè)方法。

2.  *制劑間相互親和性差異很大，因此在應(yīng)用ABC試劑時(shí)，應(yīng)注意廠家和批號(hào)，對(duì)購(gòu)進(jìn)試劑應(yīng)進(jìn)行事先預(yù)測(cè)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。

3.  標(biāo)記過(guò)程中應(yīng)始終保持組織切片的濕潤(rùn)。
 
4.  在DAB顯示液中加入鎳等金屬離子，以使反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)黑色，并用甲基綠復(fù)染核，可加強(qiáng)陽(yáng)性染色的對(duì)比度和提高靈敏度。
 
5.  在用PBS緩沖液沖洗的過(guò)程應(yīng)盡量沖洗*，片子表面不留雜質(zhì)。

6.  準(zhǔn)確配比抗體的濃度，因?yàn)闈舛冗^(guò)高和過(guò)低都不利反應(yīng)地進(jìn)行，在滴加抗體的時(shí)候，做到用量少而均勻。

7.  DAB是有毒試劑，使用過(guò)程中盡量不污染周圍環(huán)境，并且顯色過(guò)程中盡量避免DAB見光分解。

8.  滴加每種試劑做到迅速準(zhǔn)確，以免片子在反應(yīng)中干燥。

9.  ABC試劑保存溫度以4度為佳，據(jù)報(bào)告保存達(dá)兩年之久，仍能獲得滿意效果，而在-20度，生物活性在短期內(nèi)即被破壞。